علوم زيستي ورزشي _ زمستان 1389 شمارة 7- ص ص : 40- 19
تاريخ دريافت : 14/ 11 / 87 تاريخ تصويب : 16 / 06 / 88

تأثير تمرينات استقامتي و مكمل آهن بر شاخص هاي آنمي و سيتوكروم C اكسيداز در
عضلات اندام تحتاني موش هاي نر صحرايي

1. محمدعلي سمواتي شريف١ – 2. علي اصغر رواسي _ 3. باقر مينائي _ 4. ابراهيم جوادي _
5. محمدرضا كردي
1. استاديار دانشگاه بوعلي سينا همدان، 2. استاد دانشگاه تهران، 3. دانشيار دانشگاه علوم پزشكي تهران، 4. دانشيار دانشگاه علوم پزشكي تهران، 5. استاديار دانشگاه تهران

چكيده
تحقيقات نشان داده اند كه تمرينات استقامتي طولاني موجب فقر آهن (آنمي) در ورزشكاران مي شود. اين مسئله ممكن است در عملكرد فيزيكي آنان اثر منفي داشته باشد. در اين پژوهش تأثير تمرين استقامتي و مكمل آهن بر شاخص هاي آنمي (TIBC RBC, HC, Hb و فريتين) و آنزيم سيتوكروم C اكسيداز (COX) موش هاي نر صحرايي بررسي شد. به اين منظور 40 سر موش نر صحرايي نژاد 14848Wistar با ميانگين وزن 54/8±05/215 گرم به چهار گروه تقسيم شدند. گروه تجربي I تحت تمرين دو استقامت روي تردميل به مدت 12 هفته با سرعت m.min-32 به مدت 60 دقيقه در هر جلسه و 5 جلسه در هفته قرار گرفتند (T) . گروه تجربيII ، با همان برنامة تمريني، روزانه 800 ميكروگرم مكمل آهن (سولفات فرو) به صورت خوراكي (Gavage) دريافت مي كردند (Ti) . گروه كنترل بدون تمرين بودند (S) و گروه كنترل II ضمن اينكه تمرين نمي كردند، همانند گروه تجربيII مكمل آهن دريافت مي كردند (Si). پس از 12 هفته ، موش ها كشته شدند. براي اندازه گيري شاخص هاي آنمي، نمونة خوني آزمودني ها در آزمايشگاه برآورد شد. داده ها با استفاده از آناليز واريانس يكطرفه (One Way ANOVA) در سطح 05/0 P< بررسي شد. تجزيه و تحليل آماري نشان داد، پروتكل تمريني موجب شد تا گروه T دچار فقر آهن بدون كم خوني شوند، اما استفاده از مكمل آهن، علاوه بر بهبود شاخص هاي آنمي، به ا فزايش فعاليت آنزيم سيتوكروم C اكسيداز در گروه Ti منجر شد.
قابل توجه اينكه مكمل آهن اثر مثبتي روي موش هاي غيرفعال نداشت.

واژه هاي كليدي
تمرين استقامتي، هموگلوبين، هماتوكريت، فريتين، سلول هاي قرمز خون، سيتوكروم C اكسيداز و مكمل آهن.
مقدمه
حفظ شرايط بدني و استفاده از حداكثر توان و قدرت، از اصلي ترين نيازهاي ورزشي است كه ورزشكارانبراي كسب آن تلاش مي كنند. مشخص شده است كه تمرينات سخت و طاقت فرسا به تغيير در سيستم خوني و هماتولوژي ورزشكاران، به ويژه ورزشكاران زن و ورزشكاران جوان مي انجامد. به عبارتي كم خوني ناشي از فقر آهن در جوامع ورزشكاران نسبت به غيرورزشكاران و افراد ساكن شايع تر است (3، 4، 20، 24).
آهن نقش مهمي به عنوان عنصر اساسي در انتقال اكسيژن و فرايند ساخت هموگلوبين و ميوگلوبين دارد
(8). علاوه بر اين، آهن، عامل مشترك در بسياري از سيستم هاي آنزيمي از جمله سيتوكروم C اكسيداز
(Cox) است كه به عنوان يك كمپلكس آنزيم حاوي آهن و مس موجود در زنجيرة تنفسي ميتوكندري نقش مهمي در فرايند فسفوريلاسيون اكسيداتيو دارد. عملكرد و نقش آن به عنوان مجموعة چهارم (IV) زنجيرة تنفسي، دريافت الكترون از هر كدام از چهار مولكول سيتوكروم و انتقال آنها به يك مولكول اكسيژن و تبديل اكسيژن مولكولي به دو مولكول آب است (2، 30) سيتوكروم هاي موجود در زنجيرة تنفسي، ذخيرة انرژي را از طريق اكسيداسيون و احياء آهن (3+Fe+2 → eF) مهيا مي كنند. بنابراين كمبود آهن قبل از اينكه در مقدار هموگلوبين خون تأثير بگذارد، در آنزيم هاي ميتوكندريايي مؤثر است (36).
در تحقيقات بسياري گزارش شده است، انجام تمرينات ورزشي شديد و فعاليت هاي سنگين موجب كاهش آهن و ايجاد آنمي هم در انسان و هم در نمونه هاي حيواني مي شود، يعني كاهش غلظت هموگلوبين، تعداد سلول هاي قرمز خون، درصد هماتوكريت و كاهش غلظت فريتين در اين گونه مطالعات ديده شده است(13،
24). به طوري كه اين روند در طول تمرينات ورزشي به ناتواني و ضعف در عملكرد هوازي آنان منجر شده است (36).
محققان كاهش شاخص هاي آهن به ويژه فريتين (پروتئين ذخيره كنندة آهن) در ورزشكاران را ناشي از هموستاز آهن در افزايش ساخت پروتئين هاي حاوي آهن به همراه كاهش در فرايند جذب روده اي آهن و افزايش دفع آهن از طريق عرق كردن، دفع آهن روده اي و دفع آهن از طريق كليه ها (ادرار) طي تمرين مي دانند (14، 28، 36).
هينز زولر و همكاران (2004) نياز به مكمل آهن را بر اساس تغييرات مشاهده شده در مقدار خون وشاخص هاي آهن سرم در طول انجام تمرين ورزشي را مطرح كردند. آنان معتقدند كاهش زودگذر و ناپايدار درغلظت هموگلوبين به ويژه در زمان شروع تمرين براي ورزشكاران اتفاق مي افتد. اين پديده را در اصطلاح كمخوني ورزشي توصيف كرده اند كه در ورزشكاران استقامتي بسيار شايع است (15). براساس تحقيقات انجام شده، غلظت كم هموگلوبين (كمتر از 14 گرم در دسي ليتر براي مردان و كمتر از 12 گرم در دسي ليتر براي زنان) در حدود هشت درصد ورزشكاران نخبه و ماهر مشاهده مي شود (12). از طرفي، اسپوداريك و همكاران (2002) اظهار مي دارند، اقدامات مكمل سازي در ورزشكاران اغلب مقوله اي غيرقابل كنترل به نظر مي رسد. آنان عنوان مي كنند شيوع فقر آهن در ورزشكاران نخبه و حرفه اي كمتر از ورزشكاران جوان شركت كننده در برنامه هاي ورزشي است، اما اين تفاوت را به استفادة گستردة كنترل نشدة مكمل آهن در ورزشكاران حرفه اي نسبت مي دهند (20). در اين زمينه ديوگنير و همكاران (2002) گزارش دادند، از 99 دوچرخه سوار ماهر فرانسوي 83 نفر مبتلا به عارضة فريتين افزايش يافته در خون هستند. علاوه بر اين، 88 درصد ورزشكاران به طور متوسط بيش از حد متعارف تحت درمان مكمل آهن قرار مي گيرند (9).
تغييرات مشاهده شده در شاخص هاي هماتولوژي به ويژه هموگلوبين در ورزشكاران، پيچيده است. در ورزشكاران استقامت، تغيير در شكل سلول هاي قرمز خون و تخريب آنها به راحتي اتفاق مي افتد. سازوكارهاي مسئول چنين فرايندهايي در ورزشكاران متفاوت است. پيدايش عارضة هپتوگلوبين در شناگران، پارو زنان و وزنه برداران، هموليز سلول هاي خوني بر اثر ضربه هاي پا در ديگر ورزشكاران استقامتي از جمله دوندگان، از سازوكار هاي متفاوت تخريب سلولي اند (8، 11، 15).
يوگيان ليو و همكاران (2001)، گزارش داده ا ند تغيير و تحولات موجود در وضعيت آهن، به سطح شدت تمرين ورزشي بستگي دارد. آنان در آزمايش هاي خود روي موش ها نشان دادند، پس از ده هفته تمرين شديد شنا، سطح آهن خون موش ها به طور چشمگيري كاهش يافت. درحالي كه در گروه كنترل كه تحت تمرنياتملايم و متوسط قرار داشتند، سازگاري بهتري در جذب و ذخيرة آهن موش ها مشاهده شد. آنان دريافتند، اشباعآهن و ترانسفرين موجب افزايش هموگلوبين، درصد هماتوكريت و توليد سلول هاي قرمز بيشتري در موش هاشد. علاوه بر اين، سنتز ميوگلوبين و فعاليت آنزيم هاي حاوي آهن در ميتوكندري آزمودني ها افزايش يافت (35). در تحقيقات ديگر نشان داده شد موش هايي كه با رژيم غذايي كمبود آهن تغذيه مي شدند، كاهش چشمگيري در هموگلوبين همراه با افت 50 درصدي در فعاليت سيتوكروم C اكسيداز و كاهش در ظرفيت كار (زمان دويدن روي تردميل) ديده شد اما، وقتي موش ها با مكمل آهن درمان شدند، تمامي شاخص هاي فقر آهن به وضعيت طبيعي برگشت (36).
سطوح بالاي اكسيدانت هاي يافت شده در موش هاي آنمي، ممكن است در نتيجة كاهش سطوح هم و فعاليت كمپلكس IV ميتوكندري باشد. رابطه هاي آماري همة شاخص هاي زيستي در ارتباط با محتواي آهن غير هم به شكل U هستند. داده ها نشان مي دهند طيفي از سطوح آهن غير هم كبدي به عملكرد و فعاليت طبيعي ذخاير آهن وابسته است. فقر و افزايش آهن، موجب بروز آسيب هاي كاربردي در ميتوكندري مي شود. اين پاسخ در بافت ها، قانون براترند خوانده مي شود (23). در اين زمينه پاتريك و همكاران(2002) نشان دادند كمبود آهن (تغذيه بدون آهن) و افزايش آهن (تغذيه حاوي 8000 ميكروگرم آهن) به ميتوكندري بافت آسيب وارد مي كند. آنها تجويز 800 ميكروگرم آهن را به عنوان آهن نرمال توصيه مي كنند (25).
در پاره اي از مطالعات نشان داده شد، استفاده از مكمل آهن تأثيري بر توان و عملكرد ورزشكاران ندارد.
علاوه بر اين، تغييري در شاخص هاي آهن آزمودني ها ديده نشد (9، 13).
با توجه به اطلاعات به دست آمده، اين سؤالات مطرح مي شود؛ آيا ورزشكاران به ويژه ورزشكاران استقامتي با توجه به كالري مصرفي زياد به آهن بيشتري نياز دارند؟ آيا در حقيقت تمرينات استقامتي موجب فقر آهن در ورزشكاران مي شود؟ آيا اين احتمال وجود دارد كه نوع رژيم غذايي يا عادات بد غذايي منجر به فقر آهن در ورزشكاران شود، آيا مصرف بدون كنترل مكمل هاي حاوي آهن توسط ورزشكاران يا نوع رژيم غذايي، صحت وضعيت آهن ورزشكاران را تضمين مي كند؟ آيا افت عملكرد ورزشكاران به فقر آهن مربوط است؟ با توجه بهپرسش هاي مطرح شده، از آنجا كه رژيمهاي غذايي و استفاده از مكملهاي مختلفي كه توسط ورزشكاران مصرفمي شود و نوع فعاليت هاي جانبي آنها، به ويژه برنامة تمرينات تخصصي كه از طرف مربيان تجويز مي شود، نمي توان به درستي ارزيابي وضعيت آهن ورزشكاران نخبه اطمينان داشت. با اين حال، به علت وجود روش هاي تمريني متفاوت و عوامل بسيار زياد تأثيرگذار فعاليت هاي ورزشي بر سوخت و ساز آهن و شاخص هاي مرتبط با آن و تنوع ورزشكاران (مردان ، زنان و جوانان) به عنوان يك گروه مورد مطالعه، شناسايي ورزشكاراني كه به مكمل آهن نياز دارند، بسيار سخت و دشوار است. ازاين رو براي دستيابي به سؤالات مطرح شده، تصميم گرفته شد تا اثر تمرين استقامت و مكمل آهن روي موش هاي نر صحرايي تجربه شود. بر اين اساس، به طرح اين سؤال پرداخته شد كه آيا تمرين استقامتي منتخب بر موش هاي نر صحرايي عامل محدود كننده براي شاخص هاي خوني وابسته به آهن است؟ آيا استفاده از مكمل آهن طي تمرين از فقر آهن احتمالي پيشگيري مي كند؟ بر اين اساس، در اين پژوهش روي تأثير 12 هفته تمرين استقامتي و دريافت مكمل آهن به مقدار 800 ميكروگرم در روز طي تمرين بر تغييرات شاخص هاي آنمي به عنوان عامل مهم در انتقال اكسيژن و ذخائر آهن و همچنين فعاليت آنزيم سيتوكروم C اكسيداز (COX) به عنوان يك مجموعة آنزيمي حاوي آهن، در آخرين گيرندة الكترون در سيستم ميتوكندري در نمونه هاي حيواني (موش هاي نر) تمركز شده است.

روش تحقيق
اين تحقيق از نوع تجربي و آزمايشگاهي است. در اين بررسي، تغييرات شاخص هاي آنمي (TIBC ,HCT
,RBC ,HB و فريتين) و فعاليت سيتوكروم C اكسيداز در عضلة اندام هاي تحتاني موش هاي نر صحرايي، حاصل از اثر تمرين استقامتي و دريافت مكمل آهن در مقايسه با بي تمريني و دريافت مكمل آهن بررسي شد.
با توجه به شرايط مناسب مدل حيواني، براي اين تحقيق، 40 سر موش صحرايي نر 5/2 ماهه با ميانگين وزن 54/8±05/215 گرم از نژاد 14848Wista از مركز تكثير و پرورش حيوانات آزمايشگاهي انستيتو پاستور ايران، خريداري شد. حيوانات پس از انتقال به محيط آزمايشگاهي دانشكدة تربيت بدني دانشگاه تهران، به مدت دو هفته با محيط و شيوة دويدن روي تردميل مخصوص جوندگان آشنا شدند. سپس موش ها وزن كشي و بر اساسوزن، به چهار گروه متجانس تقسيم شدند.
گروه تجربي I: تحت برنامة تمريني استقامتي منتخب به مدت 12 هفته قرار گرفتند (T).
گروه تجربي II : تحت برنامة تمريني استقامتي منتخب به مدت 12 هفته قرار گرفتند و روزانه 800 ميكروگرم مكمل آهن (سولفات فرو) خوراكي دريافت مي كردند (Ti) .
گروه كنترل I: در مدت 12 هفته بدون تمرين بودند (S) .
گروه كنترل II: بدون تمرين، اما در مدت 12 هفته همانند گروه تجربي II مكمل آهن (800 ميكروگرم) دريافت مي كردند (Si) .
شيوة نگهداري موش هاي صحرايي
براي نگهداري حيوانات، از قفس هاي انفرادي پلي كربنات شفاف با قابليت اتوكلاو، ساخت شركت انستيتو رازي استفاده شد. دماي مطلوب محيط نگهداري حيوانات حدود 22-24 درجة سانتيگراد و رطوبت نسبي نيز حدود 58-64 درصد بود و چرخة روشنايي – تاريكي (12: 12 ساعت) كنترل مي شد. براي تهوية هوا در محيط آزمايشگاه از دو دستگاه تهوية بدون صدا استفاده مي شد.
تغذية موش هاي صحرايي
موش هاي صحرايي در سيستم هاي پرورشي به طور معمول با غذاهاي توصيه شده توسط مراكز توليد خوراك دام به صورت پلت تغذيه مي شوند (1). غذاي مورد نياز آزمودني ها در اين تحقيق كه از مركز پرورش و تكثير حيوانات آزمايشگاهي انستيتو رازي ايران تهيه شده بود، به صورت آزاد در اختيار آزمودني ها قرار مي گرفت. آب مورد نياز حيوانات در بطري هاي 500 ميلي ليتري ويژة حيوانات آزمايشگاهي به صورت آزاد در اختيار آنها قرار مي گرفت. به گروه تجربيTi) II ) و گروه كنترل Si) II) روزانه 800 ميكروگرم مكمل آهن(سولفات فرو) از طريق گاواژ خورانده مي شد (24).
برنامة تمريني
برنامة تمريني شامل 12 هفته دويدن فزاينده با سرعت 10 تا 32 متر در دقيقه به مدت 10 تا 60 دقيقه در هر جلسه و 5 جلسه در هفته بود. براي گرم كردن، حيوانات به مدت 3 دقيقه با سرعت 10 متر در دقيقه راه مي رفتند، سپس هر 1 دقيقه 2 متر در دقيقه به سرعت دستگاه اضافه مي شد. اين برنامه تا 7 دقيقه ادامه داشت (از دقيقة 3 تا 10). آنگاه برنامة اصلي تمرين اجرا مي شد. پس از اتمام برنامة تمريني، براي سرد كردن، سرعت دستگاه به طور معكوس كاهش مي يافت تا به سرعت اوليه (10 متر در دقيقه) برسد. مدت سرد كردن 7-10 دقيقه بود (7، 21، 26، 29).
شيوة بيهوشي و جراحي
به منظور برآورد تغييرات احتمالي اثر متغير مستقل (تمرين و مكمل آهن) بر متغيرهاي وابسته (شاخص هاي آنمي و فعاليت سيتوكروم C اكسيداز)، براساس برنامة از پيش تعيين شده، حيوانات وزن كشي شدند. سپس با استفاده از شيوة مناسب آسان كشي، موش ها كشته و جراحي شدند. عمليات جراحي و آسان كشي حيوانات به اين شكل بود كه پس از مطالعة روش هاي مختلف آسان كشي (1) و مشاوره با متخصصان، حيوانات در دستگاه ديسكاتور كه حاوي اِتر به مقدار كافي بود، قرار مي گرفتند. بعد از 2 تا 3 دقيقه حيوان بي هوش مي شد. آنگاه با باز كردن قفسه سينه، از قلب حيوان به مقدار مورد نظر خونگيري به عمل مي آمد. بلافاصله عمليات جراحي و نمونه برداري بافت ماهيچه انجام مي گرفت.
روش نمونه گيري
پس از اجراي پروتكل تمريني (12 هفته تمرين استقامتي) و بي هوشي، از قلب آزمودني ها به اندازة مورد نياز (حدود 5 سي سي) خون گرفته شد. به منظور جلوگيري از لخته شدن، بلافاصله به بخشي از خون (حدود 1 سي سي) محلول mg/lcc) EDT A 2-1) اضافه مي شد. مقداري از نمونه هاي خوني براي انجام تست CBC به آزمايشگاه حمل مي شد. مابقي خون براي اندازه گيري پارهاي از شاخصهاي آنمي در داخل لولههاي آزمايش دردستگاه سانتريفوژ قرار گرفت تا عمل جداسازي سرم آن از سلول هاي خوني انجام شود. سپس نمونه ها براي اندازه گيري عوامل مورد نظر به آزمايشگاه انتقال داده شد.
به منظور اندازه گيري فعاليت آنزيم سيتوكروم C اكسيداز، قسمتي از بافت عضلة مورد نظر (عضلة نعلي)، جداسازي و وزن كشي شد. سپس بافت جدا شده به وسيلة دستگاه هموژنوليز در دماي صفر درجة سانتيگراد، هموليزه شد. آنگاه براي جداسازي ميتوكندري از محلول به دست آمده، به وسيلة دستگاه سانتريفوژن يخچال دار، در دماي منفي 20 درجة سانتيگراد در دو نوبت عمل سانتريفوژ انجام گرفت. آنگاه با استفاده از روش لوري پروتئين هاي ميتوكندري از محلول جدا شد و در نهايت با استفاده از كيت اندازه گيري سيتوكروم C اكسيداز و دستگاه اكسپتوروفتومتر، مقدار فعاليت سيتوكروم C اكسيداز بافت برآورد شد.
محدوديت هاي تحقيق
در تحقيقات تجربي و آزمايشگاهي، استفاده از مدل هاي حيواني محدوديت هايي مثل ويژگي هاي جسماني (گونه، نژاد و سن)، عوامل محيطي (نور، دما، رطوبت)، كنترل غذايي (مكمل ها، داروها، تغذيه) و كنترل فعاليت
(مدت، شدت، استراحت) در اختيار محقق بود. اما عواملي مثل تغييرات فيزيولوژيكي احتمالي در محيط آزمايشگاه، تاثير اتر و كلروفرم روي شاخص هاي خوني و آنزيمي در كنترل محقق نبود.
روش آماري
داده هاي حاصله در اين بررسي ابتدا با استفاده از آمار توصيفي تنظيم و بررسي شد. از آزمون كولموگروف – اسميرنوف براي تعيين نحوة توزيع داده ها استفاده شد. براي ترسيم نمودارها و جداول از برنامة Excell استفاده شد. از آناليز واريانس يكطرفه (ONE WAY ANOVA) براي بررسي اختلاف بين گروه ها استفاده شد.
سطح معني دار آماري در سطح 05/0 P< تعيين شد. عمليات آماري با استفاده از نرم افزار SPSS انجام گرفت. نتايج و يافته هاي تحقيق
براي نشان دادن اثر تمرين استقامتي و تمرين استقامتي همراه با دريافت مكمل آهن در مقايسه با بي تمريني و دريافت مكمل آهن در شرايط بي تمريني بر شاخص هاي آنمي و فعاليت سيتوكروم C اكسيداز، از شكل هاي 1 تا 6 استفاده شد.
هموگلوبين (Hb) : نتايج حاصل از برآورد مقدار هموگلوبين در آزمودني ها نشان داد مقدار هموگلوبين در گروه تجربيT) I) نسبت به گروه هاي كنترل (Si,S) كمتر و سطح هموگلوبين در گروه تجربي Ti)II) نسبت به گروه هاي كنترل بيشتر بود، اما اين تغييرات معني دار نبودند. مقايسة سطوح ميانگين هموگلوبين در گروه تجربي Ti)II) نسبت به گروه تجربي T) I) افزايش معني داري (05/0 P<) به مقدار 04/1 گرم در دسي ليتر (22/7%) داشت. سطوح هموگلوبين بين دو گروه كنترل (Si,S) معني دار نبود (شكل 1).
14.4
15.44
14.94
14.88
0
2
4
6
8
10
12
14
16
(
ليتر

دسی

در

گرم

)
هموگلوبين
Ex I
Ex II
Co I
Co II
Si
S
Ti
T

*

14.4

15.44

14.94

14.88

0



قیمت: تومان


پاسخ دهید