علوم زيستي ورزشي _ زمستان 1395 دورة8، شمارة 4، ص : 531 – 517 تاريخ دريافت : 04 / 08 /93 تاريخ پذيرش : 06/ 11 / 94

بررسي اثر تمرين استقامتي شنا و مصرف كادميوم بر نشانگرهاي درون زاد هيپوكسي و رشد اندوتليال عروقي قلب موش هاي صحرايي باردار

ا حمد جعفري 1– شادمهر ميردار 2 – محسن زروار3
1. دانشجوي دكتري فيزيولوژي ورزشي دانشگاه مازندران، بابلسر، ايران 2.دانشيار دانشگاه مازندران، بابلسر،
ايران 3.كارشناس ارشد تربيت بدني دانشگاه تهران، تهران، ايران

چكيده
هدف مطالعة حاضر بررسي اثر يك دوره تمرين زيربيشينة شنا و مصرف كادميوم بر HIF-1αو فاكتور رشد اندوتليالي در قلب موش هاي باردار بود. 32 سر موش صحرايي ويستار باردار به طور تصادفي به چهار گروه كادميوم، شنا، شنا + كادميوم و كنترل تقسيم شدند. پروتكل تمرين شنا در سه هفته به صورت پنج بار در هفته و به مدت 60 دقيقه در هر جلسه در گروه شنا و شنا + كادميوم تكميل شد. كادميوم بهصورت كادميوم كلرايد محلول در آب توسط گروه كادميوم و شنا + كادميوم مصرف شد و سطوح HIF-1α و فاكتور رشد اندوتليال عروقي بافت قلب به روش اليزا اندازه گيري شد.
نتايج نشان داد مصرف كادميوم به تنهايي يا به همراه تمرين شنا به افزايش معنا دار سطوح HIF-1α و فاكتور رشد اندوتليالي منجر شد (001/0=P). تمرين شنا به تنهايي به كاهش معنا دار HIF-1αو افزايش معنادار فاكتور رشد اندوتليالي منجر شد (001/0=P) و تركيب تمرين شنا با مصرف كادميوم موجب كاهش آثار كادميوم بر متغيرHIF-1α (046/0=P) و فاكتور رشد اندوتليالي (002/0=P) شد. بنابراين، مصرف كادميوم ممكن است به افزايش غيرطبيعي HIF-1α و فاكتور رشد اندوليالي قلب موش هاي باردار منجر شود و تمرين ورزشي شنا با تعديل آثار كادميوم ممكن است از بافت قلب آنان محافظت كند.

واژه هاي كليدي
تمرين شنا، فاكتور يك القايي هايپوكسي، فاكتور رشد اندوتليال عروقي، كادميوم.
مقدمه
توانايي احساس و پاسخ به تغييرات غلظت اكسيژن يك نياز اساسي براي بقاي همة ارگانيسم هاست (35). تغييرات فشار اكسيژن بافتي ميتواند تغييراتي را در سطح ژني و سنتز پروتئين ايجاد كند. فاكتور يك القايي هايپوكسي (HIF1) در سال 1992 به عنوان فاكتور رونويسي ژن رمزگذار پروتئين اريتروپويتين انسان شناخته شد. براساس نتايج بررسي ها HIF1 يك پروتئين هترودايمر است و از يك زيرواحد تنظيمي HIF-1α و زيرواحد HIF-1β تشكيل ميشود. در صورت كاهش مقدار اكسيژن بين سلولي، فعاليت هاي آنزيمي پروليل هيدروكسيلازها مهار ميشود و اين شرايط به رونويسي هستهاي و ايجاد HIF-1α پس از شكل گيري هترو دايمر فعال HIF-1βمنجر ميشود كه به طور اساسي در رونويسي عوامل ژني سازگار با هايپوكسي شامل آنژيوژنز، گليكوليز، خونسازي و كاتكولامين ها نقش دارد (18). اين فاكتور پروتئيني يك ميانجي كليدي هنگام نمو، بارداري و فعاليتهاي عملكردي محسوب مي شود (29). امروزه بيش از صد ژن در رونويسي و ترجمة ژني HIF-1α شناسايي شدند و بيشتر از دو درصد ژن هاي انسان به طور مستقيم و غيرمستقيم در سلول هاي اندوتليال شرياني در سنتز HIF-1α دخالت ميكنند (21) كه از ميان آنها فاكتور رشدي اندوتليال عروقي(VEGF) قدرتمندترين ميتوژن مخصوص اندوتليالي است كه سلول هاي اندوتليال را نسبت به هايپوكسي كانوني و ناحية بدون عروق تحريك و تكثير آنها را تسهيل مي كند (34). مطالعات حيواني نشان ميدهد حذف ژن HIF-1α كه كدگذار پروتئين HIF-1αاست، به توقف سير پيشرفت رشد جنيني در روزهاي هشتم تا نهم و همچنين وضعيت مرگبار جنيني در روزهاي دهم تا يازدهم بههمراه ناهنجاري هاي قلبي و عروقي و همچنين كاهش خونسازي ميانجامد (11). بنابراين HIF-1αو فاكتور رشدي اندوتليال عروقي سيگنال دهنده هاي ضروري براي حفظ و نگهداري چگالي عروقي و تأمين اكسيژن در هايپوكسي بافتياند (9).
از سوي ديگر، قرار گرفتن در معرض فلزات سنگين در طول دورة رشد و نمو يك هشدار جدي برايايجاد مسموميت است. در اين بين، كادميوم فلزي نرم به رنگ نقرهاي سفيد است كه به طور طبيعي در پوستة زمين يافت مي شود؛ طعم و بوي خاصي ندارد و به صورت اكسيد كادميوم، كلرايدكادميوم و سولفيدكادميوم ديده ميشود (20). اين فلز يك آلودهكنندة محيطي- صنعتي نيز است كه بر شماري از اندام هاي انسان و ديگر پستانداران اثر مخربي دارد (40). بيان شده است مادران در معرض كادميوم ممكن است دچار اختلالات قلبي و عروقي شوند و زمان زايمان آنها تغيير يابد (31). هرچند براساس بسياري از گزارش ها به طور ويژه معطوف بر زيانبار بودن كادميوم هستند، كمبود مطالعات در زمينة بررسي ارتباط ميان مسموميت كادميوم و HIF-1α، بسيار محسوس است. شواهد علمي نشان مي دهد كه سنتز پروتئين HIF-1α به وسيلة مكانيسم هاي وابسته به اكسيژن تنظيم ميشود و وضعيتهايي چون فعاليت ورزشي حاد همراه با كاهش عمومي و موضعي فشار اكسيژن و همچنين حالت اسيدوز، استرس اكسيداتيو و استرس گرمايي در تحريك آن نقش دارند (13). برخي پژوهش ها افزايش معنا دار سطوح HIF1-α در پي تمرين شنا را، عنصر ضروري در رشد اندام ها دانسته اند (9). فلورا و همكاران (2012) نشان دادند در بافت قلب موش ها، HIF-1α و فاكتور رشد اندوتليال عروقي با انجام هر دو نوع تمرين هوازي و بي هوازي افزايش مي يابد (10). ميردار و همكاران (1392) در تحقيقي به بررسي تأثير تمرينات استقامتي شنا در دوران بارداري موش هاي نژاد ويستار بر سطوح HIF-1α در بافت رية نوزادان پرداختند.
تمرين شنا از روز اول بارداري تا روز زايمان ادامه پيدا كرد. يافته هاي اين پژوهش نشان داد سطوح HIF-1α رية نوزادان در مقايسه با گروه كنترل افزايش معنا داري داشت (2). در مقابل، برخي مطالعات در بافت هاي ديگر نتايج ديگري را در پي داشتند. اوكاوارا و همكاران (2002) بيان داشتند كه اجراي سه ماه تمرين استقامتي شنا تأثيري بر سطوح HIF-1αندارد (26). تيمون و همكاران (2005) نيز بدون تأثير بودن تمرينات دايره اي هوازي بر سطوح HIF-1α را گزارش دادند (36). براساس نتايج برخي مطالعات در نمونه هاي انساني، در شرايط نورموكسي بين mRNA فاكتور رشد اندوتليال عروقي و HIF-α1 در عضلات اسكلتي پس از تمرين استقامتي تغييرات معناداري وجود ندارد (9).
در مجموع مي توان گفت با توجه به نوع واكنش دستگاه قلبي-عروقي به تمرين شنا در مقابل آلاينده هاي محيطي و به ويژه در دوران بارداري و مشكلات دسترسي به اكسيژن از يك سو و كمبود يا فقدان مطالعات مناسب در دسترس از سوي ديگر، رسيدن به توافق نظر جمعي در اين زمينه دشوار است. بر اين اساس، پژوهش حاضر درصدد است تا به اين پرسش پاسخ دهد كه يك دورة سههفته اي تمرين استقامتي شناي زير بيشينه چه تأثيري بر تغييرات سطوح HIF1-α و VEGF بافت قلب در برابر مسموميت كادميوم دارد؟

روش
آزمودني هاي پژوهش حاضر 32 سر موش صحرايي مادة بالغ نژاد ويستار بودند. در شروع كار، پس از انتقال حيوانات از انستيتو پاستور ايران به محيط آزمايشگاه و پس از آشنايي با محيط جديد، هر جفت حيوان ماده با يك حيوان نر جفت گيري كردند. 24 ساعت بعد با بررسي تودة واژينال، اولين روز بارداري مشخص شد و سپس به مدت يك هفته جهت سازگاري با محيط جديد به صورت گروه هاي چهارتايي در قفس هاي پلي كربنات شفاف در دماي محيط 2 ± 23 درجة سانتيگراد، رطوبت 45 تا 55 درصد و چرخة تاريكي به روشنايي 12:12 ساعته نگهداري شدند. در دورة پژوهش غذاي استاندارد پلت و آب به صورت آزاد در اختيار قرار گرفت. سپس حيوانات مورد مطالعه به صورت تصادفي و مساوي به چهار گروه تقسيم شدند. گروهها عبارت بودند از: گروه كادميوم كه محلول كادميوم را مصرف كردند؛ گروه شنا كه تمرين شنا را انجام دادند؛ گروه شنا + كادميوم كه علاوهبر انجام تمرين شنا، محلول كادميوم مصرف كردند؛ و گروه كنترل كه از هر گونه مداخلات محيطي ويژه منع شده بودند. كادميوم در طول دورة بارداري به صورت كادميوم كلرايد محلول در آب به مقدار 400 ميلي گرم در ليتر از طريق آب آشاميدني مصرف شد (2). بر اين اساس، مقدار 2 گرم كلرايد كادميوم در 5 ليتر آب حل و در ظرف آب ريخته شد. ظروف آب بهطور روزانه كنترل و همواره پر مي شد، به طوري كه موشها در تمام مدت قادر به مصرف آب به مقدار دلخواه بودند. بهمنظور آشنايي با آب و كاهش استرس شنا و سازگاري با شرايط تمريني طي يك هفته به مدت 10 تا 30 دقيقه در داخل استخر آب (ابعاد 100×50×50 سانتي متر) با درجة حرارت 30 تا 35 درجه قرار گرفتند. اضافه بار تمريني از طريق تنظيم قدرت و سرعت آب استخر از هفت ليتر به دوازده ليتر در دقيقه هنگام شنا به اجرا درآمد (24). برنامة هفتگي تمرين شنا به صورت پنج روز در هفته و در روزهاي شنبه، يكشنبه، سه شنبه، چهارشنبه، پنجشنبه و دوره هاي استراحت درروزهاي دوشنبه و جمعة هر هفته بود (2) (جدول1).
جدول 1. ويژگي برنامة تمرين شنا
مدت تمرين به دقيقه روزها
10 تا 30 ي ك هفته آشنايي با آب قبل بارداري
623968967188

6239681939500

روز اول 30 روز دوم 35 هفتة اول روز سوم 40 روز چهارم 45 روز پنجم 50 روز اول 50 دوران بارداري روز دوم 55 هفتة دوم روز سوم 60 روز چهارم 60 روز پنجم 60 روز اول 60 روز دوم 60 هفتة سوم روز سوم 60 روز چهارم 60 روز پنجم 60

تعيين مقادير HIF-1αبافت قلب با استفاده از كيت ساخت كانادا (KA1321) و فاكتور رشد
اندوتليال عروقي با كيت ساخت ژاپن (27101A .Rat VEGF AssayKit – IBL) و به روش الايزا انجام گرفت. به همين منظور، نمونهگيري بافتي از قلب موش ها دو روز پس از زايمان حيوانات انجام گرفت.
بافت قلب خارج شده و با ترازوي sartorius:Bl 1500 با دقت 001/0 وزن شد. ابتدا بافتها با استفاده از مايع نيتروژن پودر شد و سپس در محلول بافر هموژنيزه و به مدت 15 دقيقه در دماي چهار درجة سانتيگراد با دور 14000rpm سانتريفيوژ شد (5). محلول حاصل براي سنجش شاخص مورد نظر با استفاده از يخ خشك به آزمايشگاه منتقل شد. براي تهية مقاطع ميكروسكوپي از نمونهها به روش معمول تهية مقاطع بافتي عمل شد. در اين روش با استفاده از دستگاه هيستوكينت مدل 2000 ساخت شركت ليكا آلمان، مراحل مختلف پاساژ شامل آبگيري، شفاف سازي و آغشتگي به پارافين انجام گرفت. سپس نمونه ها قالب گيري شده و با استفاده از ميكروتوم دوراني مدل 2035 ساخت شركت ليكا آلمان، برش هايي به ضخامت 6 -5 ميكرومتر تهيـه شدند و مورد رنگآميزي هماتوكسيلين-ائوزين (H&E)، رنگ آميزي اختصاصي پريوديك اسيد شيف (PAS) و تري كروم مالوري قرار گرفتند. در نهايت اسلايدهاي ميكروسكوپي به منظور بررسي تغييرات ساختاري و سلولي مطالعه شد. براي مطالعة هيستومتريك و تعيين تغييرات كمي در ساختار بافتي و سلولي بافت قلب حداقل 10 برش بافتي از هر نمونه و در هر برش حداقل 10 ميدان ديد ميكروسكوپي شمارش و بررسي شد. كلية بررسي هاي ميكرومتري با استفاده از عدسي چشمي مدرج و اسلايد كاليبره انجام گرفت و در نهايت نتايج تغييرات حاصل در گروه هاي مختلف مورد آزمون با استفاده از ميكروگرافهاي تهيه شده ارائه و مشخص شد.
تجزيه وتحليل آماري داده هاي متغيرها با آزمون كروسكال واليس و ومن ويتني يو (به دليل نامتجانس بودن واريانس ها) در سطح معناداري 05/0 ≤P و با نرم افزار SPSS 16 انجام گرفت.
يافته ها
ميانگين و انحراف استاندارد مقادير HIF1-α و فاكتور رشد اندوتليال عروقي (VEGF) بافت قلب آزمودني ها در جدول 2 آورده شده است. بررسي داده ها نشان داد بيشترين مقدار HIF1-α به گروه كادميوم و كمترين مقدار به گروه شنا تعلق داشت. در بررسي داده هاي فاكتور رشد اندوتليالي، بيشترين ميانگين به گروه كادميوم و كمترين ميانگين به گروه كنترل تعلق داشت (جدول2).
جدول 2. مقادير HIF1-α و VEGF برحسب شاخص مركزي و پراكندگي در گروههاي پژوهش
انحراف استاندارد ميانگين N گروه متغير
25/6
151/13
7/34 158/5
411/75
86/25 8
8
8 كنترلكادميومشنا (پيكوگرم بر HIF1-α ميلي ليتر)
11/9 212/5 8 شنا + كادميوم 12/04
50/70 131/87
421/37 8
8 كنترل
كادميوم (پيكوگرم بر ميلي ليتر)VEGF
11/94 189/75 8 شنا 32/38 308/5 8 شنا + كادميوم مقايسة تغييرات متغير HIF1-α و فاكتور رشد اندوتليال عروقي (VEGF) با آزمون كروسكال واليسنشان داد كه بين گروه ها تفاوت معنا داري وجود دارد (001/0=P) (جدول3).

جدول 3. بررسي اختلافات بين گروه ها با آزمون كروسكال واليس HIF1-α و VEGF
P(sig) مربع كاي( 2) ميانگين رتبه گروه متغير

0/000
* 26/991 12/62
26/88 كنترل
كادميوم
HIF1-α
4/00 شنا 22/00 شنا + كادميوم
0/000
* 28/739 4/50
28/25 كنترل
كادميوم
VEGF
12/50 شنا 20/76 شنا + كادميوم * معنا داري در سطح 05/0 ≤ α
در ادامه، نتايج آزمون منويتني يو در متغير HIF1-αنشان داد بين گروه هاي كنترل و كادميوم (001/0=P)، كنترل و شنا (001/0=P)، كنترل و شنا + همراه كادميوم (001/0=P)، كادميوم و شنا
(001/0=P)، كادميوم و شنا + كادميوم (046/0=P)، شنا و شنا + كادميوم (001/0=P) اختلاف معنا داري وجود داشت (شكل 1).
شكل 1. بررسي مقادير HIF1-α در گروه هاي چهارگانه (* : نشانة تفاوت معنا دار

158.5
*
+ 411.75
*#

212.25
* # + 86.25
0
100
200
300
400
500
كنترل
كادميوم

شنا
+
كادميوم
شنا
HIF1-
α
(PG/ML)




75
/
411



25
/
212


+
25
/
86

158.5

*

+

411.75

*#



قیمت: تومان


پاسخ دهید