علوم زيستي ورزشي – تابستان 1396 دورة9، شمارة 2، ص: 221 – 209 تاريخ دريافت : 08 / 06 / 95 تاريخ پذيرش : 10 / 12 / 95

تأثير يك دوره مكمل دهي عصارة دارچين بر پاسخ nAChR عضلة اسكلتي موش هاي صحرايي سالمند به فعاليت حاد وامانده ساز

ف تانه فرهمند 1 – مريم نورشاهي 2 – مجتبي صالح پور3 – ايمان فتحي 4
1.دانشجوي دكتري فيزيولوژي ورزشي عصب و عضله، دانشكدة تربيت بدني و علوم ورزشي، دانشگاه شهيد بهشتي، تهران، ايران 2. دانشيار، دانشكدة تربيت بدني و علوم ورزشي، دانشگاه شهيد بهشتي، تهران، ايران
3.استاديار، دانشكدة تربيت بدني و علوم ورزشي، دانشگاه تربيت دبير شهيد رجايي، تهران، ايران 4. استاديار، گروه تربيت بدني و علوم ورزشي، دانشكدة ادبيات و علوم انساني، دانشگاه ولي عصر رفسنجان، رفسنجان، ايران

چكيده
مصرف مكملهاي حاوي آنتي اكسيدان در بهبود عملكرد در دوران سـالمندي اهميـت زيـادي دارد. هـ دف ايـن تحقيـق،بررسي تأثير يك دوره مكملدهي عصارة دارچين بر پاسخ گيرندة نيكوتيني استيل كولين (nAChR)پس از يـك جلسـهفعاليت وامانده ساز در موش هاي صحرايي سالمند بود. 32 سر موش سالمند نژاد ويستار به طـور تصـادفي در چهـار گـروه ورزش وامانده ساز، دارچين، دار چـين– ورزش و كنتـرل تقسـيم شـدند . مـوش هـا در گـروه دارچـين و دارچـ ين- ورزش mg/kg/day 200 عصارة دارچين بهمدت 14 روز به صورت گاواژ در يافـت كردنـد. در گـروه ورزش و دارچـين– ورزش، موش ها ابتدا با سرعت m/min 10 براي گرم كردن روي تردميل راه رفتند و سپس هر دو دقيقه، m/min 2 به سرعت تردميل اضافه شد تا سرعت به m/min 28 رسيد. پس از بيهوشي، عضلة SOL و EDL در حالت استراحت، بلافاصـله و چهار ساعت بعد خارج شد. از روش هموژن كردن و سپس وسترن بلات براي شناسايي تغيير متغيرها اسـ تفاده شـدند . داده ها با استفاده از آزمـون تـي مسـتقل و تحل يـل واريـانس يكطرفـه (One Way ANOVA) در سـطح معنـاداري (05/0 ≤P) تجزيه وتحليل شدند. نتايج پژوهش نشان داد كه ميـزان nAChR بلافاصـله و چهـار سـاعت بعـد در عضـل ة SOL، در همة گروه ها به طور معناداري بيشتر از گروه كنترل بود (05/0˂ P). با وجود اين در عضلة EDL اين افزايش معنادار نبود (05/ 0≥P). به نظر مي رسد كه مكمل دهي عصارة دارچين و فعاليت اسـتقامتي، روش مناسـبي بـراي كـاهشتوسعة ساركوپنيا و افزايش سنتز nAChR در افراد سالمند باشد.

واژه هاي كليدي
ساركوپنيا، سالمندي، فعاليت وامانده ساز، گيرندة نيكوتيني استيل كولين.
مقدمه
سالخوردگي1 ارگانيسم براساس كاهش تدريجي عملكرد تمام سيستم هاي بدن مشخص مي شود. تغييرات مرتبط با سن در سيستم عصبي، ممكن است بر عملكرد ديگر سيستم هاي بدن و فرايندهاي پيري اين سيستم ها اثرگذار باشد. سيناپس ها، واحدهاي عملكردي سيستم عصبي هستند و سالمندي بر عملكرد سيناپس ها اثر مي گذارد (2). سالمندي با كاهش عملكرد جايگاه عصبي – عضلاني (به عنوان يك سيناپس)، كاهش قدرت عضلاني، كاهش سرعت انقباض عضلاني و افزايش خستگي عضلاني ارتباط دارد و اين تغييرات نيز با كاهش تودة عضلاني مرتبط است (31). به طوركلي، اين كاهش تودة عضلاني با سالمندي و فرايندهاي سلولي و مولكولي مربوط به آن، ساركوپنيا2 نام دارد (21). فرايند سالمندي سيناپس هاي كولينرژيك، پيچيده است و ممكن است شامل مواردي همچون كاهش آزادسازي استيل كولين از سيناپس ها در نتيجة كاهش ورود كلسيم از طريق كانال هاي كلسيمي وابسته به ولتاژ (28) و همچنين كاهش تحريك پذيري الكتريكي غشاي پلاسمايي سيناپسي در نتيجة كاهش فعاليت آنزيم الكتروژنيك سديم-پتاسيم ATPase باشد (27).
تحقيقات در زمينة تغييرات سيستم عصبي طي سالمندي نشان مي دهد كه سالمندي سبب كاهش تعداد تارهاي عصبي ميلين دار، قطر تارهاي عصبي، تعداد واحدهاي حركتي و كاهش سرعت هدايت پيام عصبي و غيره مي شود (4). در اين بين يكي از تغييرات مهم در دوران سالمندي، تغيير ساختاري و عملكردي جايگاه اتصال عصبي ـ عضلاني3 (NMJ) است؛ به طوري كه كاهش عملكرد و ساختار اين قسمت طي سالمندي سبب تضعيف عملكرد جسماني مي شود (15، 11). محققان نشان دادند كه انتقال سيناپسي سريع و دقيق نيازمند تجمع و چگالي زياد گيرنده هاي انتقالدهندة پيام عصبي در غشاي پس سيناپسي است. به همين دليل اين گيرنده ها بايد در قسمت مقابل منطقة آزادسازي ناقلان از پايانة عصبي، با چگالي زياد وجود داشته باشند. در همين زمينه، سازش پذيري NMJ به طور گسترده اي در مدل هاي تحريك الكتريكي، فرايند قطع عصب/ عصب رساني مجدد4 و بي باري عضله نشان داده شده است (20). همچنين مشاهده شده است كه تغييرات مرتبط با سن در مورفولوژي NMJ ممكن است در انواع عضلات اسكلتي متفاوت باشد و احتمالاً با سطوح فعاليت عضله مرتبط است (30).
.1 senescence
.2 sarcopenia
.3 neuromuscular junction
.4 Denervation/re-innervation process
دوره مكمل دهي عصارةپاسخعضلةموش هاي
تحقيقات دربارة اثر فعاليت ورزشي بر فيزيولوژي و مورفولوژي NMJ بسيار محدود است (12).
برخي مطالعات نشان داده اند كه فعاليت ورزشي بر تعداد و توزيع گيرنده هاي استيل كوليني يا فعاليت هاي ويژة كولين استيل ترانسفراز و استيل كولين استراز اثري ندارد (19). در پژوهشي، فهيم محمد (1997) به بررسي اثر ورزش استقامتي (28 متر بر دقيقه، 60 دقيقه در روز) بر مورفولوژي NMJ عضلة دوقلوي موش هاي سالمند پرداخت و نتيجه گرفت كه NMJ تغييري فيزيولوژيكي و مورفولوژيكي طي سالمندي متحمل مي شود و اين پلاستيسيتي ممكن است در اثر ورزش استقامتي تعديل شود (12).
در ميان نظريه هاي مختلف در توضيح فرايند سالمندي نظرية توليد راديكال هاي آزاد 1(ROS) در طول دو دهة گذشته بررسي شده است. پيشنهاد اوليه دربارة فرايند سالمندي و ROS را هارمن مطرح كرد كه به عنوان يك توضيح ممكن در زمينة فرايند سالمندي پذيرفته شد. نظرية ROS و سالمندي نشان مي دهد كه توليد ROS در سالمندان بسيار بيشتر از افراد جوان است(19). تحقيقات مختلف نشان داده اند كه فعاليت ورزشي شديد و فرايند سالمندي سبب افزايش توليد ROS مي شوند (32). اگرچه ROS در مقادير زياد سبب آسيب هاي ساختاري و مرگ سلولي و در بسياري از شرايط پاتوژنز – به طور ويژه تخريب نوروني2 درگيرند (6)، نشان داده شده است كه در مقادير كم تا متوسط براي تندرستي و داشتن نقش هاي مختلف نظارتي در سلول ضروري اند (25).
از سوي ديگر، اظهار شده است كه مكمل هاي حاوي مواد آنتي اكسيداني و گياهان دارويي هم در انسان و هم در حيوان مي توانند آسيب ناشي از ROS به بافت هاي مختلف را كاهش دهند (5). برخي از گياهان دارويي به دليل وجود تركيباتي مانند پلي فنوليك3 آنتي اكسيدان قوي به شمار مي روند (3). از جمله مواد طبيعي و در دسترس كه حاوي خاصيت قوي آنتي اكسيدان است دارچين4 است كه چاشني رايجي در وعده هاي غذايي مردم آسيايي است. فعاليت آنتي اكسيداني روغن هاي ضروري و عصاره هاي برگ و پوست درخت دارچين در داخل بدن و در شرايط آزمايشگاهي گزارش شده است (22).
تحقيقات زيادي در مورد اثرهاي ورزش و رژيم غذايي در جلوگيري از كاهش عملكرد عضلاني مرتبط با سن انجام گرفته است (17،14) با وجود اين، اطلاعات در مورد اثرهاي ورزش و مكمل هاي غذايي بر NMJ محدود است (29). البته تحقيقات محدودي در زمينة اثرهاي طولاني مدت ورزش بر
Reactive oxygen species
.2 Neurodegenerative
3. Polyphenolic compounds
.4 Cinnamon
جايگاه عصبي- عضلاني انجام گرفته است، با اين حال تأثيرات يك وهله ورزش شديد بر جايگاه عصبي-عضلاني و نقش مكملهاي غذايي آنتي اكسيداني در پيشگيري از آسيب هاي ناشي از افزايش راديكال هاي آزاد و آثار مخربشان بر جايگاه عصبي – عضلاني بررسي نشده است.
با توجه به اينكه تحقيقات نشان مي دهند فعاليت هاي ورزشي شديد با افزايش توليد (ROS) همراهاند (18) و بهطور معمول دستگاه هاي دفاع آنتي اكسيداني درون زاد به تنهايي نمي توانند با آن مقابله كنند (13) و سبب تأثيرات مخرب بر NMJ مي شود و همچنين با توجه به اينكه در سالمندي سطوح ROS افزايش مي يابد، اين مطالعه به بررسي اين فرضيه مي پردازد كه آيا يك دوره مكمل دهي عصارة دارچين ( بهعنوان آنتي اكسيدان قوي) ميتواند اثرهاي مخرب راديكال هاي آزاد ناشي از فعاليت حاد واماندهساز و سالمندي بر ساختار و عملكرد جايگاه NMJ را تعديل كند يا خير ؟

روش تحقيق نمونه ها
در اين پژوهش، 32 سر موش نر ويستار 22 ماهه با ميانگين وزني 25±375 گرم به عنوان نمونه از مركز تكثير و پرورش حيوانات آزمايشگاهي دانشكدة پزشكي دانشگاه تهران خريداري و در شرايط دمايي 4/1 ± 22 درجة سانتي گراد، رطوبت 4 ± 55 درصد و چرخة روشنايي-تاريكي 12:12 ساعت در قفس هايي از جنس پلي كربنات نگهداري شدند. موش ها در همة مراحل پژوهش به غذاي مخصوص و آب آشاميدني كه در ظرف هاي مخصوص آب حيوانات وجود داشت، به اندازة كافي و آزادانه دسترسي داشتند.
تمام حيوانات در هفتة اول با شرايط زندگي در آزمايشگاه آشنا شده و سپس به چهار گروه هشت تايي تقسيم شدند گروه هاي پژوهش حاضر به شرح زير بودند:
گروه اول فعاليت استقامتي وامانده ساز (8=EX) ،(n)؛ گروه دوم، دريافت مكمل دارچين (8=n)، (CE) در هفتههاي دوم و سوم بهمدت 14 روز با دوز mg/kg/day 200 (6)؛ گروه سوم، دريافت مكمل دارچين بهمدت 14 روز با دوز mg/kg/day 200 همراه با فعاليت وامانده ساز (8=EX+ CE) ،(n) كه شامل يك جلسه فعاليت استقامتي وامانده ساز بود؛ گروه كنترل (بدون ورزش و بدون مكمل)
.(Cont)(n=8)

دوره مكمل دهي عصارةپاسخعضلةموش هاي
پروتكل ورزشي
حيوانات به منظور آشنا شدن با تردميل، ابتدا 10 دقيقه با سرعت 12- 8 متر بر دقيقه به مدت سهروز دويدند. پس از پايان دورة مكمل دهي، گروه مكمل دارچين و ورزش وامانده ساز و گروه ورزش وامانده ساز، فعاليت استقامتي روي تردميل را انجام دادند. در روز فعاليت ورزشي، موش ها ابتدا 10 دقيقه با سرعت 10 متر بر دقيقه براي گرم كردن روي تردميل راه رفتند، سپس به تدريج هر 2 دقيقه، 2 متر بر دقيقه به سرعت تردميل اضافه شد تا به سرعت ثابت 28 متر بر دقيقه رسيد. حيوانات در اين سرعت كه معادل80- 75 درصد حداكثر اكسيژن مصرفي است، تا حد واماندگي دويدند. همچنين در تمام مراحل يادشده، شيب نوارگردان صفر درجه بود (24). واماندگي زماني محسوب مي شد كه وقتي حيوانات را به پشت خوابانديم قادر به برگشت به وضعيت اوليه نبودند (9).
تهية عصارة دارچين
عصارة متانولي پوستة دارچين در آزمايشگاه پژوهشكدة گياهان دارويي دانشگاه شهيد بهشتي تهيه شد. دارچين گياه بومي هند و سريلانكاست. بنابراين پوستة خشك درخت دارچين از عطاري تهيه و به صورت پودر درآورده شد و 350 گرم از پودر تهيه شده درون يك بشر 1000 ميلي ليتر ريخته و روي آن 600 ميلي ليتر متانول خالص (به طوري كه تمامي پودر را بپوشاند) اضافه شد.
نمونة تهيه شده چندين بار به هم زده شد و به مدت 24 ساعت به همين صورت باقي ماند. بعد از 24 ساعت فاز بالايي برداشته و روي باقي مانده ماده دوباره متانول ريخته شد و به هم زده شد. اين كار به مدت پنج روز انجام گرفت تا عصارة گياه به طور كامل استخراج شد. سپس كل فازهاي بالايي صاف شده و با استفاده از دستگاه روتاري حلال آن جدا شد و 30 گرم عصارة غليظ و خشك به دست آمد (8). عصارة تهيه شده براي مصرف موش هاي صحرايي به صورت گاواژ در محلول دي متيل سولفوكسيد (DMSO) 1/0درصد حل شد.
نمونه گيري
بلافاصله و چهار ساعت پس از واماندگي، موشها با تزريق درون صفاقي تركيبي از كتامين1 (50-30 ميلي گرم/كيلوگرم وزن بدن) و زايلزين2 (5 -3 ميلي گرم/ كيلوگرم وزن بدن) بيهوش شده و به منظور بافت برداري از محفظه خارج و به روي ميز جراحي انتقال داده شدند. دو عضلةSOL و EDL براي
.1 Ketamine
.2 Xylazine
اندازه گيري مقدار پروتئين nAChR به روش وسترن بلات (Anti- nAChR شركت abcam) بلافاصله وچهار ساعت پس از فعاليت وامانده ساز برداشته شدند.
تهيه و آماده سازي بافت
ابتدا عضلات براي استخراج عصارة سلولي (سوپرناتانت) با روش هاون كوبي پودر شد. سپس نمونه هاي پودر شدة عضله توسط بافر هموژن (pH= 8 ،Tris-HCL 500μL ، 003/0 گرم EDTA، 08/0
گرم NaCl، 025/0 گرم سديم دي اكسي كلات1، 01/0 گرم SDS، 1 قرص Protease inhibitor cocktail، 10 ميكروليتر NP40 (0.1%)) براي به دست آوردن عصارة سلولي ليز شد.
براي هموژن كردن بافت، به اندازة چهار تا پنج برابر وزن نمونه ها بافر ليز كننده ريخته شد و با هموژنايزر تامي مدل ميكرو اسمش در 3000 دور در دقيقه بهمدت سه زمان دودقيقه اي با فاصلة زماني پنج دقيقه اي بين دفعات براي جلوگيري از گرم شدن و دناتوره شدن پروتئين، هموژن شد. سپس بافت هموژن شده به مدت 10 دقيقه در دماي 4 درجة سانتيگراد و در 3600 دور در دقيقه سانتريفيوژ شد.
سوپرناتانت محلول جدا و در فريزر 80- نگهداري شد. براي تعيين غلظت پروتئين از روش بردفورد استفاده و با استفاده از منحني استاندارد، غلظت مناسب پروتئين نمونه محاسبه شد.
وسترن بلات
براي اجراي آزمايش وسترن بلات مقادير مساوي از پروتئين توسط ژل پلي آكريل آميد SDS-PAGE12% جداسازي شد. بعد از مرحلة الكتروفورز، پروتئين هاي ژل به كاغذ PVDF منتقل شد و كاغذ به مدت 1 ساعت در محلول بلاكينگ قرار گرفت. سپس كاغذ يك شب در آنتي بادي اوليه (Anti- nAChR شركت abcam) در 4 درجة سانتي گراد قرار گرفت و در روز دوم سه بار با محلول TBST شست وشو داده شد و با آنتي بادي ثانويه به مدت يك ساعت انكوبه شد. بعد از اين مرحله، بلات ها با كيت ECL پوشانده و با استفاده از فيلم راديولوژي ظاهر شدند؛ سپس در بافر استريپينگ شستوشو داده شدند و آنت يبادي بتا اكتين روي كاغذ گذاشته شد و دوباره با آنتي بادي ثانويه انكوبه شدند و بتااكتين كنترل نيز در فيلم راديولوژي ظاهر شد. توسط برنامة Image J باندهاي به دست آمده دانسيتومتري شدند.
تجزيه وتحليل آماري
تجزيه وتحليل دادهها با استفاده از نرم افزار آماري SPSS با VER=16 انجام گرفت. طبيعي بودن داده ها
.1 Sodium Deoxycholate
دوره مكمل دهي عصارةپاسخعضلةموش هاي

با استفاده از آزمون شاپيروويلك مشخص شد. براي بررسي معناداري اختلاف سطوح nAchR، بلافاصله وچهار ساعت پس از فعاليت و اماندهساز در چهار گروه از آزمون يكسوية آنوواي مستقل استفاده شد. برايمشخص شدن تفاوت معنادار بين گروه ها در صورت معناداري از آزمون هاي تعقيبي بانفروني و در غير اين صورت از گيمزهاول استفاده شد. سطوح معنا داري نيز (05/0 ≤P ) در نظر گرفته شد.

نتايج
نتايج آزمون آماري تحليل واريانس يكسويه نشان داد كه ميزان تغييرات پروتئين nAchR عضلة بازكنندة دراز انگشتان (EDL) در تمام گرو هها، بلافاصله و چهار ساعت بعد معنادار نبود (05/0P) (نمودار 1، جدول 1).

1
nAchR:
β
actin(A.U.)EDL
nAchR
β
اكتين

0
0
.5
1
.5
2
2
.5
3
Co

n
ه
CE
Axis Ti
ل
بلافاص
ساعت

EX-CE
t
le
4
EX

1

nAchR:

β

actin(A.U.)EDL

nAchR

β

اكتين



قیمت: تومان


پاسخ دهید